现代观点认为动脉粥样硬化的始动环节为内皮完整性的破坏，其中内皮细胞凋亡与增生的不平衡是极为重要的因素。吸烟、高脂血症、高血糖、氧化应激等均可导致内皮细胞的过度凋亡，破坏血管内膜，这种解剖结构的破坏又进一步导致了内皮功能的紊乱。目前，对细胞凋亡机制及抗凋亡机制的研究比较多，抗氧化、抑制氧自由基是许多学者研究的热点问题。步长脑心通为中药复方制剂，由黄芪、水蛭、地龙、全蝎、当归、川芎、丹参、赤芍、红花、桂枝、牛膝等成分组成，用于治疗缺血性心脑血管疾病，如脑血栓形成引起的脑梗死，也适用于脑动脉硬化和冠心病的治疗。现拟用过氧化氢（H2O2）制备人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡模型，采用血清药理学的方法观察含步长脑心通血清对细胞凋亡的影响。

材料与方法
试剂与药品
步长脑心通药粉由步长制药厂生产，TUNEL试剂盒购自Rche公司，Wistar大鼠购自吉林大学动物中心；HUVECs购自上海拜力生物科技有限公司（原代细胞为美国ADCC公司所制备），H2O2购自北京化工厂。
步长脑心通含药血清的制备
12只Wister大鼠随机分3组，应用步长脑心通溶液灌胃（灌药前禁食不禁水12 h），分为低、中、高剂量组，灌胃剂量分别是0.5 g/kg、1.0 g/kg、1.5 g/kg（相当于成人每公斤体重的5倍、10倍和20倍）。每日1次，连续7天。于最后1次灌药后2 h眼球采血，室温静置2～4 h待血凝后，4℃冰箱过夜，3000 r/min离心10 min，提取血清，同组血清混匀，经56℃ 30 min灭活处理后，0.22 μm滤膜过滤除菌，-70℃保存备用。
制备H2O2所致的人脐静脉内皮细胞的凋亡模型
冻存的HUVECs复苏传代后，用含10%小牛血清的培养液制备单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种至96孔板，每孔培养液体积约200 μl，放置于含5% CO2的37℃孵箱。
培养至对数生长期后每孔加入200 μmol/L H2O2作用6小时，制备细胞凋亡模型。
实验分组
传代细胞随机分为5组，即正常对照组、模型组、低浓度含药血清组、中浓度含药血清组、高浓度含药血清组，每组设5个复孔。
96孔板种植传代细胞（1×104 cells／wel1），分组如前，每组5个复孔，选择对数生长期的细胞，每组加入H2O2 100 μl（200 μ mol/L），正常对照组不加H2O2，37℃避光孵育6小时；给药组在H2O2刺激前，加入不同浓度含步长脑心通大鼠血清预培养24 h。停止孵育，每孔加MTT溶液20 μl。继续孵育4 h，终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。
比色：选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度A值（?字±s），记录结果。
细胞传代铺于24孔板中（1×104 cells／wel1）（清洁的载玻片预先铺至24孔板中），分组如前。待生长至单层融合，除正常对照组外各组加入200 μmol/L H2O2刺激6 h，给药组在H2O2刺激前，加入不同浓度含步长脑心通大鼠血清预培养24 h。
所有的实验至少重复3次，后TUNEL试剂盒检测各组细胞凋亡率。
统计学方法
所有数据应用SPSS13.0软件包进行处理。实验数据均以?字±s表示，组间资料应用单因素方差分析。

结果
不同浓度含药血清对HUVECs凋亡率的影响
酶联免疫检测仪上490 nm处测定吸光度A（n=5，?字±s），见表1。HUVECs在H2O2作用下细胞增殖率明显下降，与正常对照组相比，差异有显著性（P<0.05）；不同浓度含步长脑心通血清组细胞增殖率较模型组增高，差异有显著性（P<0.05），与正常对照组比较，差异无显著性（P>0.05），表现出保护作用。
不同浓度含药血清对HUVECs增殖率的影响
与正常对照组相比，加入了H2O2后各组细胞凋亡率明显增加（见图1、表2）。DAB显色的结果显示：正常对照组细胞呈梭性或者多角形，细胞核大而饱满，可见分叶状核仁，而凋亡的细胞原有形态消失，胞体变小，细胞核核仁固缩，核染色加深，分叶状核消失。与正常对照组相比，模型组和含药血清组细胞凋亡率均明显增加，差异有显著性（P<0.01）；与模型组比较，不同浓度含药血清组细胞凋亡率均下降，差异有显著性（P<0.05）。


讨论
动脉粥样硬化性疾病在发达国家已经成为主要的死亡原因。氧自由基损伤是血管内皮细胞损伤的原因之一，是细胞发生凋亡的重要因素，血管内皮细胞过度凋亡破坏了动脉内膜的完整性，进而导致内皮功能下降，这是动脉粥样硬化发生的重要机制之一。有学者提出内皮细胞凋亡是动脉粥样硬化发生的早期事件，因此保护血管内皮细胞的药物对抗动脉粥样硬化有一定作用。
H2O2对内皮细胞的影响主要是损伤了线粒体膜。过氧化氢可产生活性氧，活性氧在生理状态下不断产生，但是过高浓度的活性氧即可引起细胞损伤，甚至导致细胞结构不可逆的损伤即细胞凋亡，血管内膜是机体具有内分泌功能的器官，对活性氧具有一定灭活作用，然而过多活性氧会导致内膜稳定性和通透性平衡失调，这种损伤导致其灭活功能的下降，进而影响血管的舒缩功能和抗血栓形成的能力，内皮功能失调是动脉粥样硬化的早期标志，这一观点已经得到许多学者的认同。在此基础上，脂质渗透、脂蛋白氧化、炎症反应和成纤维细胞增殖、细胞外基质沉积溶解、血小板活化和血栓形成，动脉粥样硬化因此而形成。
本研究成功制备了H2O2所致细胞凋亡模型，并加入不同浓度的含药血清进行干预，结果显示中药步长脑心通在保护血管内皮方面有着一定的疗效。已有研究证实步长脑心通可通过促进 HUVEC一氧化氮（NO） 的合成释放，减轻 HUVEC的损伤、凋亡而发挥对血管内皮的保护作用。也有研究报道步长脑心通能够减少摄取氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）的新型受体LOX-1表达，而OX-LDL是血管内皮损伤的因素之一，这可能也是其保护血管内皮的机制。步长脑心通是多种中药的复方制剂，其有效成分中的水蛭、全蝎、地龙等含有血栓溶解因子，对缺氧所致的细胞线粒体损伤有一定的保护作用，在本实验的凋亡模型中，脑心同治理论代表药步长脑心通抗凋亡机制可能为减弱氧自由基的损伤从而起到细胞保护作用，但具体的作用机制仍有待于进一步研究。