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免疫金的特性和制备
来源:张博士医考官网   作者:张博士医考编撰 2020-09-15 15:34:18
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免疫金的特性和制备

免疫金的特性和制备:

(一)免疫金的特性

胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合,在免疫组织化学技术中,习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质(抗原或抗体)结合,这类胶体金结合物常称为免疫金复合物,或简称免疫金。

胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚,一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷,与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素,其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。

(二)免疫金的制备

1.0.2mol/LK2CO30.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点,也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。

在调节胶体金的pH值时应注意,胶体金会阻塞pH计的电极,不可直接将电极插入胶体金溶液中,宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇(PEG20000)稳定胶体金后,再胶体金的pH值。

2.1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中,放置室温反应25min.

由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附,并可使胶体金聚沉,因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度,应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐张博士医考搜集整理。

3.加入浓度为0.2%PEGBSA以饱和游离的胶体金。

4.离心分离,去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异:对5nm金颗粒可选用40000r/min离心1h8nm金颗粒用 25000r/min离心45min14nm金颗粒用25000r/min离心30min40nm金颗粒用15000r/min离心30min.

5.轻吸上清液。沉淀用含PEGBSA的缓冲液悬浮,恢复原体积后再离心。如此洗涤24次。以彻底除去未结合的蛋白质。

6.免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。缓冲溶液常用中性的PBSTris缓冲液。

多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂,PEGBSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用:一为保护胶体金的稳定 性,使之便于长期保存;二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的,不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。

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