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公卫医师考试大纲——黑热病诊断标准及处理原则
北京张博士医考公卫医师考试大纲——黑热病诊断标准及处理原则
北京张博士医考张银合博士携全体优秀老师助大家考试顺利通过！
血清学诊断（补充件）
B1检测抗体B1.1间接荧光抗体试验（IFA ）
一般以病人血清作试验。婴、幼儿病例因采血不便，可用滤纸干血滴法。
B1.1.1抗原片：收集经三恩氏（NNN ）基培养10天左右的利什曼原虫前鞭毛
体，离心沉淀（3000r/min ）15min ，弃上清液，加生理盐水冲匀，再经离心洗
涤3 次后，用含0.2 ％福尔马林0.01mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲盐水（PBS ）固定，
置冰箱内1h取出，离心沉淀，弃上清，再用PBS 洗涤一次，稀释至每个视野50～
100 个鞭毛体，滴于玻片上，电扇吹干。此抗原片，可置－20℃冰箱中备用。
B1.1.2干血滴的制备：在滤纸上圈画1.2cm 直径的圆圈，在圈内滴入2 滴
（相当于20mm3 ）病人耳垂血，晾干后放入装有干燥剂的塑料袋内，置冰箱保存
待查。
B1.1.3从滤纸上剪下干血滴，以0.2mL0.01mol/L pH7.2的PBS 浸泡，相当于
1 ∶20血清的稀释度（如被检样本为血清，则作1 ∶20稀释），置冰箱内过夜。
试验时继续作倍比稀释至1 ∶320 或1 ∶640 ，把不同稀释度的血清或干血滴浸
泡液分别滴在抗原片上，置湿盒内于37℃温育30min 后，用pH7.2 ～8.0 的PBS
缓慢洗去血清或干血滴浸泡液，再以PBS 浸泡10min ，继续用蒸馏水洗一次，电
扇吹干。
B1.1.4分别滴加1 ∶10稀释的荧光标记的羊抗人IgG ，置湿盒内于37℃温育
30min ，如前清洗，电扇吹干待检。
B1.1.5检查时在玻片上加蒸馏水一滴，覆以盖玻片，在荧光显微镜或用6 ×
40倍的光学显微镜在高压汞灯荧光光源的配合下进行观察。阳性者虫体的胞浆及
鞭毛呈黄绿色荧光，轮廓清楚，而核及动基体一般不显荧光。
B1.1.6每次试验均以病人干血滴（或血清）和正常人干血滴（或血清）浸泡
液及PBS 作对照，由于正常人血样在1 ∶20稀释时亦偶可出现“＋”，故以“＋”
为阳性标准，并以1 ∶20（即1 ∶20＋＋）为最低阳性稀释度。
B1.2 PVC薄膜快速ELISA B1.2.1抗原（前鞭毛体可溶性抗原）：收集利什曼
原虫前鞭毛体，以生理盐水离心洗涤3 次，按压积体积加10倍量的0.01％硫柳汞
生理盐水，在冰浴中超声处理2 次，每次10min ，反复冻融5 次，经4000r/min
离心3min，上清液存－20℃贮存备用。
B1.2.2操作方法：B1.2.2.1实验前先在PVC 致敏膜背面上编号，然后每孔加
血清稀释液（PBS/T ）0.2mL. B1.2.2.2 按编号加入待测血清及参考血清（每批
设一个阴性对照，一个阳性对照），每孔10μL ，混匀置37℃ 5min （如放25℃
室温，则需10min ）。
B1.2.2.3温育后，倾去稀释血清，用洗涤液（NaCl/T）连续洗8 次，空干。
B1.2.2.4加入按工作浓度稀释的酶结合物，每孔0.2mL ，放37℃内5min. B1.2.2.5
倾去酶结合物，先用洗涤液洗8 次，再用蒸馏水洗一次，空干。
B1.2.2.6加入已加3 ％过氧化氢（H2O2）的四甲基联苯胺（TMBs）底物液，
每孔0.2mL ，反应5 ～10min ，即可观察结果。
B1.2.3反应标准：目视判断：按每批的阳性对照及阴性对照判断结果。阳性
为鲜蓝色，阴性基本无色。
分光光度计比色判断：不用过氧化氢（H2O2）终止，选用595nm 波长比色，
以P/N ≥ 2.1判为阳性（P-患者的光密度值；N-正常人的光密度值）。
B1.3间接血凝法（IHA ）
B1.3.1取培养10～12天的利什曼原虫前鞭毛体，用生理盐水洗涤，按压积量
加4 倍生理盐水，于冰浴中用150W，18kc，300mA 功率超声处理10s ，以pH6.4 ，
0.075mol/L的PBS 稀释20倍。Folin 酚试法测蛋白量为200 μg/mL. B1.3.2醛化
：用健康人“Ｏ”型红细胞加10倍生理盐水离心4 ～5 次。每8mL 压积红细胞加
1 ％戊二醛100mL ，在4 ℃水浴中摇动30min ，醛化红细胞再用生理盐水和蒸馏
水或去离子水各洗5 次，最后稀释成15％，另加万分之一硫柳汞防腐，置冰箱内
保存。
B1.3.3致敏：用pH7.2 ，0.75mol/L 的PBS 将醛化红细胞稀释为1.5 ％，离
心洗3 次，配成5 ％的细胞悬液加等量万分之一的鞣酸溶液，置37℃水浴中30min
，每3～5min摇一次，用5 倍量上述的PBS 洗3 次，再用pH6.4 ，0.075mol/L的PBS
配成2.5 ％的红细胞悬液，然后以此红细胞悬液加等量pH6.4 的PBS 稀释20倍的
抗原，在37℃水浴中致敏45min ，并加摇动，2000r/min 离心3min后弃上清，加
pH7.2 的PBS 重复离心一次，最后以含有1 ％正常兔血清的pH7.2 的PBS 配成1
％备用。
B1.3.4将定量生理盐水滴加于稀释板上，于第一孔内加等量待检血清，混匀
并倍比稀释成2 －1 ，2 －2 …2-12等浓度。取每一浓度血清0.025mL 分别加入
微量血凝板的12个6mm ×7mm 的"V" 井内，再加等量致敏红细胞摇匀，置于湿纱
布盒内，经室温1h后判定结果，同时用参考阳性和阴性血清作对照。凡患者血清
稀释度达2 －7 凝集者作阳性阈值，无凝集者为阴性反应。
B2检测循环抗原B2.1单克隆抗体－抗原斑点试验（McAb－AST ）
B2.1.1待检血清递次作倍比稀释，分别取2 μL 滴于硝化纤维滤膜（0.45μ
m ）上，室温放置30min. B2.1.2 将滤膜浸入标准缓冲液（0.1mol/L三羟甲基氨
基甲烷）（Tris）－HCl pH7.4. 0.25 ％明胶，0.5 ％NP－40）内，室温2h. B2.1.3
取出滤膜浸入McAb-C-2（1 ∶100 稀释）内，4 ℃过夜。
B2.1.4以缓冲液洗涤后与辣根过氧化物酶（HRP ）标记兔抗鼠IgG （1 ∶1000），
于室温中孵育2h. B2.1.5洗涤后将滤膜置二氨基联苯胺底物液中，室温内反应30min，
蒸馏水洗涤终止反应。
B2.1.6滤膜干燥后目测以出现深棕色或棕色斑点，边缘清晰，直径较正常人
血清反应为大者则判为阳性反应。未出现棕色斑点，与正常对照血清反应相近者
为阴性反应。为更精确阅读结果，可待滤膜干燥后用岛津双波长TLC 扫描仪（CS
－910 ，S 460nm ）测读光密度面积积分（Integral of surface area.ISA），
阈值＞1.0 以上者为阳性反应；阈值＜1.0 为阴性反应。
B2.2酶标记单克隆抗体斑点－ELISA 直接法（McAb dot－ELISA ）
B2.2.1以戊二醛二步法标记提纯的单克隆抗体制备成HRP －McAb L12F7，－
30℃保存备用。
B2.2.2将待测血清依次作倍比稀释至1 ∶8.吸取2 μL 样本滴于硝酸纤维膜
上，4 ℃阴干。
B2.2.3滴有血清的硝酸纤维（NC）膜置于标准缓冲液（0.1mol/L Tris －HCl
pH7.4 0.25％明胶，0.5 ％NP－40）内，室温摇床洗涤4 次，每次10min. B2.2.4
洗涤后加1 ∶100 稀释的HRP －McAb，室温摇床2h，标准缓冲液洗涤6 次，每次
10min. B2.2.5 加底物4 －氯乙萘酚摇床10min ，水洗中止反应。
B2.2.6目测以出现蓝灰色斑点者为阳性反应。阴性则无蓝灰色斑点或仅有血
清痕迹。
B2.2.7每次试验均需设有阳性及阴性对照。
B2.3单克隆抗体酶联免疫电转移印斑技术（McAb－EITB）
B2.3.1血清样品处理：每份待检血清各取50μL ，加pH7.4 的PBS 至1mL ，
3000r/min30min，取上清加0.2mL30 ％聚乙二醇（PEG 分子量6000），4 ℃过夜，
3000r/min30min，再以50％PEG 洗涤，3000r/min30min，最后沉淀物加50μLPBs
溶解备用。
B2.3.2十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS －PAGE）技术：实验使用
10％分离胶（浓缩液3.3 μL ，3mol/L Tris －HCl 1.25mL，10％十二烷基硫酸
钠（SDS ）100 μL ，四甲基乙二胺（TEMED ）5 μL ，10％过硫酸胺Ap50μL ）。
3 ％浓缩胶（浓缩液0.5mL ，1mol/LTris－HCl 0.625mL ，H2O23.8mL ，10％SDS50
μL ，TEMED5μL ，10％Ap25μL ）。待胶板聚合完成后，每槽上样处理血清2
μL.将制板插入电泳槽中，200V电泳50min. B2.3.3 电泳转移：将胶膜覆盖在硝
酸纤维膜上对正，排除气泡。开动电源，电流为200mA ，电压为15V ，电泳30min
即可。
B2.3.4转移后硝酸纤维膜用标准缓冲液（Tris－HCl pH7.4 ，明胶0.25％，
0.5NP －40）洗三次，每次10min. B2.3.5 加1 ∶500 稀释的HRP －McAb L12H4，
37℃1h后4 ℃过夜，标准缓冲液洗三次，DAB －H2O2系统显色10min ，水洗中止
反应。
B2.3.6目测特异性条带，以130kD 、100kD 和25kD为阳性条带。
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