将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待测菌的琼脂平板表面特定部位，该点称为抗菌药源。药物借其分子的扩散力向周围琼脂扩散，形成了随着与药源距离加大，琼脂中药物浓度逐渐减少的梯度浓度。其药源周围一定区域的琼脂内药物浓度高于抑制该待测菌所需浓度时，则该区域内细菌不能生长，形成透明抑菌圈。抑菌圈的大小可以反映待测菌对该测定药物的敏感程度，并与该药对待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

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