北京张博士医考检验考试辅导之——免疫组化技术切片方法的选择

北京张博士医考张银合博士携全体优秀老师助大家考试顺利通过！

免疫组化技术切片方法的选择

应用于光镜的免疫组织化学染色的切片厚度一般要求5μm左右，神经组织的研究要求切片厚度在20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。

1.冰冻切片：是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。

冰冻时，组织中水分易形成冰晶，往往影响抗原定位。一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。因此，应尽量降低冰晶的数量。Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33℃，从-30℃降至-43℃之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。

2.石蜡切片：其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃下进行，以尽量减少组织抗原的损失。②组织块大小应限于2cm×1.5cm×0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸蜡。③浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以溶点低的软蜡最好（即低温石蜡包埋）。

石蜡切片为常规制片技术，切片机多为轮转式，切片厚度2～7μm，应用范围广，不影响抗体的穿透性，染色均匀一致。由于甲醛固定、有机熔剂和包埋剂对组抗原有一定的损害及遮蔽，使抗原特征发生改变。有人报告经蛋白酶消化，可以改善光镜免疫组化染色强度，常用的有胰蛋白酶、链霉蛋白酶及胃蛋白酶等消化法。石蜡切片应入37℃恒温箱过夜，这样烤片可减少染色中脱片现象，切片如需长期贮存，可存放于4℃冰箱内备用。

石蜡切片优点较多，但在制片过程中要经过酒精、二甲苯等有机溶剂处理，组织内抗原活性失去较多，有人采用冷冻干燥包埋法，可以保存组织内可溶性物质，防止蛋白变性和酶的失活，从而减少了抗原的丢失。该法是将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机在真空、低温条件下排除组织内水分，然后用甲醛蒸气固定干燥的组织，最后将组织浸蜡、包埋、切片。此法可用于免疫荧光标记、免疫酶标记及放射自显影。

3.振动切片：用振动切片机，可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切成厚片20～10μm，以漂浮法在反应板进行免疫组织化学染色，然后在解剖显微镜下检出免疫反应阳性部位，修整组织进行后固定，最后按电镜样品制备、脱水、包埋、超薄切片、染色观察等。组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能较好地保留组织内脂溶性物质和细胞膜抗原，主要用于显示神经系统抗原分布研究。这种包埋前染色，尤其适用于免疫电镜观察。

4.塑料切片：塑料包埋切片常用包埋剂有甲基丙烯酸盐类（GMA）及环氧树脂类（Epon 812，618），其优点是可以同时作光镜和电镜检测，能相互对照所查抗原，定位准确。塑料包埋切片可切出比石蜡切片更薄的切片，光镜切片可薄至0.5～2μm，故称半薄切片。

GMA保存抗原较好，不与组织产生共聚合，但形态学结构欠佳。环氧树脂如Fpon和Araldite能较好地保存形态学结构，但在聚合过程中易和组织起作用，改变抗原结构。塑料包埋切片由于处理程序繁多，抗原活性易丢失。同时半薄切片进行免疫染色时，抗血清不易穿透树脂，因此，塑料切片主要用于免疫电镜的超微切片前定位。包埋前染色的标本，切片薄切片后不需染色，直接在相差显微镜下观察免疫反应部位呈黑点状，定位后进一步作超薄切片，这样，可以明显提高免疫电镜阳性检出率。

「张博士医考www.guojiayikao.com整理，如有转载，请注明出处」