原理：

外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

实验设备：

移液管、1ml移液器、刻度吸管、5ml注射器、EP管、显微镜、离心机。

实验材料：

肝素、淋巴细胞分离液、RPMI1640粉末、稀释液（生理盐水）。

操作流程：

1.在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。

2.无菌采集静脉血若干毫升,注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每1ml全血加0.1ml125-250U/ml肝素溶液）,加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝。

3.稀释（外周血：稀释液=1：2取肝素抗凝血与等量生理盐水充分混匀）。

4.用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，张博士医考注意保持清楚的界面（Ficoll：稀释血=1：2）。

5.放入离心机1500r/min离心20min（注：缓慢加速1-4档个3分钟）。

6.用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入5倍以上体积的稀释液（生理盐水），1500rpm×10分钟离心，洗涤细胞。

7.重复洗涤一次，1500rpm×10分钟离心。

8.末次离心后，弃上清，加入含有10%小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。

9.计数细胞后再调整细胞置所需浓度。

10.取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。

11.分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。

注意事项：

1.每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞。

2.温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果。

3.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面。

4.Ficoll应适量，外周血应充分稀释。

5.吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染。

淋巴细胞计数：

实验流程：

1.准备计数板。

2.制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液。

3.加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。

4.计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。

5.计算：将结果代入下式，得出细胞密度。

胞数/毫升原=（4大格细胞数之和/4）×104。

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