（1）原理：有的细菌可产生β-半乳糖苷酶，能分解邻硝基酚β-D-半乳糖苷（ONPG），而生成黄色的-硝基酚（O-nitrophenol），在很低浓度下也可检出。

（2）试剂：0.75M ONPG溶液：取80mg溶于15ml蒸馏水中，在加入缓冲液（6.9gNaH2PO4，溶于45ml蒸馏水中，用30%NaOH调整pH为7.0，再加水至50ml）5ml，置于4℃冰箱中保存。ONPG溶液为无色，如出现黄色，则不应再用。

（3）方法：从培养基上取菌，于0.25ml无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置37℃水浴5分钟，加入0.25ml ONPG试剂，水浴20分钟～3小时观察结果。

（4）结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20～30分钟内显色。

（5）应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。