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特异性IgG抗体制备

2018-09-07 12:54:34 浏览次数:0 网友评论 0

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特异性IgG抗体的制备:

在标记的免疫测定或其他技术中将特异性抗体纯化出来,是极为重要的。例如在ELISA,用于包被的抗体一定要用特异性IgG,才能得到良好的效果。 这是因为全血清中有大量非抗体蛋白,如白蛋白、α1和α2球蛋白等,如不除去,会干扰包被。再如反相间接血凝,致敏红细胞的抗体也需用特异性IgGIab')2才能使实验满意。特异性IgGFab')2的制备方法有如下几种。

(一)粗提法提取球蛋白

大多用硫酸铵盐析法或硫酸钠盐析法。硫酸铵盐析须经过多次沉淀,第一次用40%饱和度,第二次用35%饱和度,第三次用33%饱和度,经三次提取后 的γ球蛋白基本是IgG成分。硫酸钠法更简便,用20%即可将γ球蛋白沉淀出来。经盐析后的γ球蛋白虽大多属于IgG,但还有5%其他区带蛋白,如γ区的 杂蛋白。又因IgG组分中还含其他所谓正常的IgG,北京张博士医考中心搜集整理产生干扰。因此盐析法粗提的γ球蛋白只能用于一般的实验,或者是抗体效价较高的 抗血清。

(二)离子交换层析法提取IgG

常用的离子交换剂有DEAE纤维素或QAE纤维素,以QAE-Sephadex最为理想,DE223252也可应用。取QAE- SephadexA25A50经酸处理并在0.05mol/LpH7.58.6的磷酸盐缓冲液中平衡,将水分抽干,称湿重Ig加于10ml血清中,在 室温30min后,离心或过滤除去离子交换剂。上清液再如此处理一次,即获得较纯的IgG,甚至不含其他杂蛋白。用该技术纯化IgG简便,不损坏抗体,既 可小量提取,也可大量制备。

(三)亲和层析法提取特异性IgG

将纯化抗原或粗制抗原(如是单价特异性则对抗原要求不高)交联Sepharose4B制成亲和层析柱,将抗血清过柱后洗去未结合的杂蛋白,再用硫氰 酸钾洗脱,流出的是纯的特异性IgG抗体。因硫氰酸钾对抗体有破坏作用,应及时透析除去。纯化的IgG因含量低,失去保护作用,应及时应用或冻干保存,亦 可20℃保存,但皆不理想;加入三乙醇胺或甘油可起保护作用。

(四)酶解法制备Fab')2片段

胃蛋白酶对IgG的作用点是在连接两重链的二硫键靠C端处(232氨基酸处),结果两个Fab由二硫键连接,保留了抗体的结合点。与IgG相 比,Fab')2的特点是去掉了Fc段,这样在细胞免疫实验中免除了受体作用;同时也使IgG失去主要的抗原特性,不被抗IgG抗体结合;在反向间接血 凝中,用Fab')2致敏羊红细胞比用IgG效果好。

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