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流式细胞仪操作过程样本的质量控制

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流式细胞仪操作过程样本的质量控制:

用于流式分析的样本种类很多,包括外周血、骨髓穿刺液、骨髓活检物、组织活检物、浆膜腔积液、脑脊液、皮肤、黏膜(内窥镜活检物)、细针穿刺物等等。样本的条件控制可能是免疫表型分析质控最困难的环节之一。每种样本都有不同的采集、保存、运输和制备要求。首先,观测样本外观:有严重溶血、凝聚或坏死的样本应弃用。

第二,单细胞悬液的获取:外周血和骨髓穿刺液为天然单细胞悬液;活检组织常用机械分离和酶消化两种方法。不同的实验要求适用不同的方法。对于需要进行膜抗原标记的,不仅是要获得足够的单细胞悬液,还要尽量保证细胞结构的完整性和抗原性,机械法较适用。只需进行细胞周期或DNA倍体分析的,在机械法的基础上加酶消化(如胰蛋白酶、胃蛋白酶等)较适用。

第三,抗凝剂的选择:外周血标本可采用EDTA、ACD或肝素抗凝。如果用同一份血标本做白细胞计数和流式分析,则应用EDTA抗凝;对于血小板分析的实验,一般不用肝素抗凝。
北京张博士医考搜集整理骨髓穿刺液常用肝素或EDTA抗凝。由于相对大量的ACD会通过改变pH而影响骨髓细胞活性问题,通常不推荐用ACD作骨髓穿刺液的抗凝剂。

第四,样本的保存:理想状态下,样本应在采集后立刻进行处理和染色。肝素抗凝的血和骨髓通常可保存至48-72小时/室温(16-25);EDTA抗凝的外周血和骨髓可保存12-24小时/室温(16-25);ACD抗凝的外周血可保存至72小时/室温(16-25);对于只作胞内染色的样本,可固定细胞以长期保存。但此“固定-染色”的方法取决于要分析的抗原特性和染色方式。

第五,去除红细胞的方法:红细胞裂解法,操作简单、快、并最可能保持原始标本的白细胞分布。最好在染色后溶血。若在染色前溶血,需确认:(1)抗原性不被溶血过程改变;(2)溶血剂被彻底洗去,细胞和抗体结合的动力反应未受影响;(3)所用溶血剂不含固定剂,否则会影响细胞活性及表面标记结果。密度梯度离心法,靶细胞回收较好并可能得到富集,同时去除红细胞、碎片等,但费时,某些重要细胞群体可能被选择性丢失。

第六,细胞与抗体的比例:厂家推荐的抗体用量通常是假定靶细胞数量在5X105 ~1x106范围内。有些标本没有足够的细胞,有些则由于细胞量大,正常浓度下的抗体相对过量或不足,导致假阳性或假阴性结果。因此,每个实验室应根据不同于厂家推荐的方法,调整细胞与抗体用量,得到最适的细胞/抗体比例。

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